MBNL loss in motoneurons : impact on motor unit function in Myotonic Dystrophy
Perte des protéines MBNL dans les motoneurones : impact sur la fonction de l’unité motrice dans la Dystrophie myotonique
Résumé
Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is a rare inherited disease with muscle, heart and cognitive impairments. DM1 is caused by CTG repeat expansions in the 3'UTR of the DMPK gene. DMPK mutated RNAs aggregate and sequester Muscleblind-like RNA (MBNL) binding proteins, leading to RNA metabolism abnormalities in several tissues. The MBNL family is composed of MBNL1, 2 and 3 but only MBNL1 and 2 are expressed in the nervous system. While skeletal muscle has been extensively studied in DM1, previous reports also suggest an impairment of communication between motor neurons (MNs) and skeletal muscle through the neuromuscular junction (NMJ) in DM1. To determine the role of MBNL proteins in MNs, we generated MN-dKO mice invalidated for Mbnl2 specifically in MNs (MN-Mbnl2-KO) in a Mbnl1 null background (Mbnl1-KO). MN-Mbnl2-KO mice don’t manifest a phenotype, however MN-dKO mice progressively develop coordination defects compared to Mbnl1-KO mice. In 4-month-old mice, MN-dKO mice motor disorders are accompanied by severe and global structural and ultrastructural abnormalities of the NMJ. In contrast, Mbnl1-KO mice NMJ alterations seem to be confined to the post-synaptic part. Thus, the loss of Mbnl1 and Mbnl2 in MNs exacerbates NMJ alterations caused by the loss of Mbnl1 alone. Interestingly, NMJs from younger MN-dKO mice exhibit early structural defects compared to NMJs from control and Mbnl1-KO mice, which are unaffected. However, and despite their abnormal appearance, NMJs of MN-dKO mice are mature at this age. These results suggest that MBNL1 and MBNL2 proteins play a role in the NMJ maintenance. Furthermore, defects caused by the Mbnl1 and Mbnl2 loss in MNs are more severe, global but also manifest earlier than those caused by the loss of Mbnl1 alone. In order to identify RNA targets deregulated by the loss of Mbnl1 and/or Mbnl2 in MNs, we conducted high-throughput RNA sequencing, using RNA extracts from lumbar spinal cords of 4 months old MN-dKO; MN-Mbnl2-KO; Mbnl1-KO and control mice. An alternative splicing analysis revealed numerous targets specific to MN-dKO mice, thus due to the simultaneous loss of Mbnl1 and Mbnl2. Interestingly, GO-Term analysis of RNA targets common to MN-dKO and MN-Mbnl2-KO or Mbnl1-KO mice showed that MBNL2 loss in MNs affects the maturation of genes involved in neurotransmitter transport or synaptic vesicle docking whereas MBNL1 loss affects the maturation of genes involved endocytosis processes. Thus, MBNL1 and MBNL2 may be involved in different processes in MNs. To complete the study of the role of MBNL proteins in NMJ and neuromuscular communication maintenance, adult WT mice were injected with adeno-associated adenovirus expressing a shmiR targeting Mbnl1 and Mbnl2 specifically in skeletal muscle. 2 months post-injection (PI), NMJs from these mice partly recapitulated NMJ defects observed in 4-month-old Mbnl1-KO mice, confirming a role for Mbnl1 in skeletal muscle on JNM maintenance. These postsynaptic abnormalities progressively extend to the presynaptic side of the junction 4 months PI. This aggravation confirms the role of MBNL1 in skeletal muscle on NMJ maintenance. The whole of my thesis work highlights the importance of MBNL proteins in MNs for neuromuscular communication. My work suggests, for the first time, that MBNL loss in MNs may contribute to DM1 muscle pathophysiology.
La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie rare héréditaire avec des atteintes musculaires, cardiaques et cognitives. La DM1 est due à des expansions de répétitions CTG dans la partie 3’UTR du gène DMPK. Les ARN DMPK mutés s’agrègent et séquestrent les protéines de liaison à l’ARN Muscleblind-like (MBNL), menant à des anomalies du métabolisme des ARNs dans plusieurs tissus. La famille MBNL est composée de MBNL1, 2 et 3 mais seuls MBNL1 et 2 sont exprimés dans le système nerveux. Alors que le muscle est largement étudié dans la DM1, des études antérieures suggèrent également une altération de la communication entre les motoneurones (MNs) et le muscle squelettique via la jonction neuromusculaire (JNM). Pour déterminer le rôle des protéines MBNL dans les MNs, nous avons généré des souris MN-dKO invalidées pour Mbnl2 spécifiquement dans les MNs (MN-Mbnl2-KO) avec une déplétion constitutive de Mbnl1 (Mbnl1-KO). Les souris MN-Mbnl2-KO ne présentent pas de phénotype, cependant les souris MN-dKO développent progressivement des défauts de coordination par rapport aux souris Mbnl1-KO. Chez les souris âgées de 4 mois, les troubles moteurs des souris MN-dKO s’accompagnent d’anomalies structurales et ultrastructurales sévères et globales de la JNM. A contrario, les altérations de la JNM des souris Mbnl1-KO semblent cantonnées à la partie post-synaptique. Ainsi, la perte de Mbnl1 et Mbnl2 dans les MNs aggrave les altérations de la JNM causées par la perte de Mbnl1 seul. Une analyse plus précoce chez des souris âgées de 2 mois a permis de montrer que les JNM des souris MN-dKO présentent des défauts structuraux par rapport aux JNM des souris contrôles mais aussi Mbnl1-KO. En revanche, et malgré leur aspect anormal, les JNM des souris MN-dKO de 2 mois sont matures. Ces résultats suggèrent que les protéines MBNL1 et MBNL2 jouent un rôle dans le maintien des JNM et que les conséquences de la perte de Mbnl1 et Mbnl2 dans les MNs sont plus sévères, globales et se manifestent plus précocement que celles de la perte de Mbnl1 seul. Afin d’identifier les cibles dérégulées par la perte de Mbnl1 et/ou Mbnl2 dans les MNs, un séquençage ARN à haut-débit, associé à une analyse bio-informatique de l’épissage alternatif, a été réalisé à partir d’ARN extrait de moelles épinières lombaires des souris MN-dKO, MN-Mbnl2-KO, Mbnl1-KO et contrôles âgées de 4 mois. Cette analyse a mis en évidence de nombreuses cibles spécifiques aux souris MN-dKO, et donc à la perte conjointe de Mbnl1 et Mbnl2. De manière intéressante, l’analyse GO-Term des ARN cibles communs aux souris MN-dKO et MN-Mbnl2-KO ou Mbnl1-KO a permis de montrer que la perte de MBNL2 affecte la maturation de gènes impliqués dans le transport de neurotransmetteurs ou l’amarrage des vésicules synaptiques alors que la perte de MBNL1 affecte la maturation de gènes impliqués dans les processus d’endocytose. Ainsi, MBNL1 et MBNL2 seraient impliqués dans des processus différents au sein des MN. Afin de compléter l’étude du rôle des protéines MBNL dans la maintenance de la JNM et de la communication neuromusculaire, des souris WT adultes ont été injectées avec des adeno-associated adenovirus exprimant un shmiR ciblant Mbnl1 et Mbnl2 spécifiquement dans le muscle squelettique. 2 mois post-injection (PI), les JNMs de ces souris récapitulent en partie les anomalies observées chez les souris Mbnl1-KO âgées de 4 mois, confirmant un rôle de Mbnl1 dans le muscle squelettique sur le maintien de la JNM. Ces anomalies post-synaptiques s’étendent progressivement au côté présynaptique de la jonction 4 mois PI. Cette aggravation confirme le rôle de MBNL1 dans le muscle squelettique sur le maintien de la JNM. L’ensemble de mes travaux de thèse soulignent l’importance des protéines MBNL dans les MNs pour la communication neuromusculaire et suggèrent, pour la première fois, que la perte de MBNL dans les MNs pourrait contribuer à la pathophysiologie musculaire de la DM1.
Origine : Version validée par le jury (STAR)