Changes in Calcium Cycling and Its Mechanisms in Sinoatrial-node underlying the TAC-induced Heart Failure in Mouse
Changements dans le cycle du calcium et ses mécanismes dans le nœud sino-auriculaire sous-jacent à l'insuffisance cardiaque induite par la TAC chez la souris
Résumé
Heart failure (HF) is the final outcome of several chronic diseases that affect the heart function, and manifests as the inability of the heart to maintain blood flow to meet the body's needs first at effort and then at rest. HF is usually accompanied by rhythm abnormalities including sinus node dysfunction.Heart rhythm is fixed by the automatic activity of the primary pacemaker, the sinoatrial node (SAN), which fix the heart rhythm by automatically generating action potentials (AP). The firing of the AP depends on the diastolic depolarization, which brings the membrane potential to the AP threshold. This depolarization is caused by the opening of ion channels located at the sarcolemmal membrane (membrane clock), and at the sarcoplasmic reticulum (SR) (calcium clock), working together in what it has been named coupled-clock. Although some studies have pointed to alteration of the membrane clock in HF, the calcium clock mechanisms is understudied.Thus, in this thesis we aim to analyse the calcium clock in an experimental model of HF by transverse aortic constriction (TAC) in the mouse. Control animals were subjected to sham surgery. HF was determined by reduced ejection fraction by M-mode echocardiography. Congestive HF was determined by enhanced lung weight/tibia length. Electrocardiograms recorded by telemetry showed similar basal HR in both sham and HF mice. However, the HR variability was lower in HF mice, as well as the intrinsic HR under autonomous nervous system (ANS) blockade by intraperitoneal injection of atropine and propranolol (2mg/kg each). These results show pacemaker dysfunction in HF mice.In order to analyze the underlying mechanism, we dissected the SAN and loaded it with a fluorescent Ca2+ indicator, fluo-4 and viewed it by confocal microscopy. The [Ca2+]i transient rate was slower in HF and its decay significantly longer suggesting alteration in SERCA and/or NCX function. Indeed, Western-Blot assays showed depressed expression of NCX and increased expression of Phospholamban (PLB, a natural SERCA inhibitor when not phosphorylated) in HF group. Moreover, PLB was relatively less phosphorylated at the site phosphorylated by CaMKII (T17). Taken together, the longer decay time could be the result of less NCX expression and more SERCA inhibition. The decreasing of the SERCA function could decrease the SR Ca2+ load, as was found by rapid caffeine perfusion in HF SAN cells.In order to assess the RyR2activity, we analyzed Ca2+ sparks, elementary events produced by activation of a RyR2s cluster. Ca2+ sparks frequency was significantly smaller in HF group, along with reduced peak amplitude and duration. Thus, the calcium released during diastole through Ca2+ sparks were smaller in HF group, indicating impairment of the Ca2+ clock.In order to further investigate the change in RyR2 at the molecular level, we performed Western-Blot. The expression level of RyR2 in HF SAN was significantly decreased, and the relative phosphorylation at S2814 site (CaMKII site) was significantly decreased. Together with the reduced PLB phosphorylation at T17 suggested that the activation level of CaMKII in HF SAN might be altered. However, the CaMKII expression was similar in the two groups, although its phosphorylation level was significantly decreased, indicating less activation. To test functional significance, we perfused a CaMKII inhibitor, KN93 on the SAN tissue and analysed Ca2+ movements. KN93 significantly decreased transient rate in both groups, indicating some basal activation, but the effect was proportionally less in HF SAN, making the rate even faster in HF SAN.To conclude, we have found that CaMKII is less activated in SAN from HF mice. As a consequence, PLB and RyR2 are less phosphorylated, slowing the Ca2+ clock. Moreover, the expression level of RyR2 and NCX, two main factors of the Ca2+ clock are decreased, further impairing the sinus node function in HF.
Le rythme cardiaque est fixé par l'activité automatique du stimulateur cardiaque principal, le nœud sino-auriculaire (SAN), qui fixe le rythme cardiaque en générant automatiquement des potentiels d'action (AP). La mise à feu du PA dépend de la dépolarisation diastolique, qui amène le potentiel membranaire au seuil AP. Cette dépolarisation est provoquée par l'ouverture de canaux ioniques situés au niveau de la membrane sarcolemmale (horloge membranaire), et au niveau du réticulum sarcoplasmique (SR) (horloge calcique), travaillant ensemble dans ce qu'il a été appelé horloge couplée. Bien que certaines études aient signalé une altération de l'horloge membranaire dans l'IC, les mécanismes de l'horloge calcique sont sous-étudiés.Ainsi, dans cette thèse, nous cherchons à analyser l'horloge calcique dans un modèle expérimental d'HF par constriction aortique transverse (TAC) chez la souris. Les animaux témoins ont été soumis à une chirurgie factice. HF a été déterminée par une fraction d'éjection réduite par échocardiographie en mode M. L'IC congestive a été déterminée par une augmentation du poids pulmonaire / de la longueur du tibia. Les électrocardiogrammes enregistrés par télémétrie ont montré une FC basale similaire chez les souris simulées et HF. Cependant, la variabilité HR était plus faible chez les souris HF, ainsi que la HR intrinsèque sous blocage du système nerveux autonome (SNA) par injection intrapéritonéale d'atropine et de propranolol (2mg/kg chacun). Ces résultats montrent un dysfonctionnement du stimulateur cardiaque chez les souris HF.Afin d'analyser le mécanisme sous-jacent, nous avons disséqué le SAN et l'avons chargé avec un indicateur fluorescent de Ca2 +, fluo-4 et l'avons observé par microscopie confocale. Le taux transitoire [Ca2 +] i était plus lent dans HF et sa décroissance significativement plus longue suggérant une altération de la fonction SERCA et / ou NCX. En effet, les tests Western-Blot ont montré une expression déprimée de NCX et une expression accrue de phospholamban (PLB, un inhibiteur naturel de SERCA lorsqu'il n'est pas phosphorylé) dans le groupe HF. De plus, la PLB était relativement moins phosphorylée au site phosphorylé par CaMKII (T17). Pris ensemble, le temps de désintégration plus long pourrait être le résultat d'une moins d'expression de NCX et d'une plus grande inhibition de SERCA. La diminution de la fonction SERCA pourrait diminuer la charge SR Ca2+, comme cela a été constaté par une perfusion rapide de caféine dans les cellules HF SAN.Afin d'évaluer l'activité RyR2, nous avons analysé les étincelles de Ca2+, événements élémentaires produits par l'activation d'un cluster RyR2s. La fréquence des étincelles de Ca2+ était significativement plus petite dans le groupe HF, avec une amplitude et une durée de pic réduites. Ainsi, le calcium libéré pendant la diastole par les étincelles de Ca2+ était plus petit dans le groupe HF, indiquant une altération de l'horloge Ca2+.Afin d'étudier plus en détail le changement de RyR2 au niveau moléculaire, nous avons effectué Western-Blot. Le niveau d'expression de RyR2 dans HF SAN a été significativement diminué, et la phosphorylation relative au site S2814 (site CaMKII) a été significativement diminuée. Avec la phosphorylation réduite de PLB à T17 a suggéré que le niveau d'activation de CaMKII dans HF SAN pourrait être modifié. Cependant, l'expression de CaMKII était similaire dans les deux groupes, bien que son niveau de phosphorylation ait été significativement diminué, indiquant moins d'activation. Pour tester la signification fonctionnelle, nous avons perfusé un inhibiteur de CaMKII, KN93 sur le tissu SAN et analysé les mouvements de Ca2 +. KN93 a significativement diminué le taux de transitoires dans les deux groupes, indiquant une certaine activation basale, mais l'effet était proportionnellement moindre dans HF SAN, rendant le taux encore plus rapide dans HF SAN.
Origine : Version validée par le jury (STAR)