Characterization of Plasmodium falciparum membrane transporters as potential antimalarial targets
Caractérisation de transporteurs membranaires de Plasmodium falciparum en tant que potentiel cibles thérapeutiques
Résumé
New drug discovery for malaria treatment urges, now more than ever. There is no optimal solution to the search for new antimalarials. Worldwide, researchers have focused their energies on several strategies. The most commonly employed are: either by screening molecules issued from chemical libraries in a phenotypic way (i.e., direct testing of drugs on in vitro parasite cultures), or by searching for new molecules acting upon the activity of a specific essential target or pathway. This PhD thesis centers on the second type of approach. We are interested in targeting membrane transporters of P. falciparum. For this, we plan to express proteins of interest in yeast and proceed to their isolation. With optimized functional tests, we aim to: a) Determine the effect of molecules upon specific targets; b) Test their effect on P. falciparum in vitro erythrocytes cultures; c) As well as verify their toxicity on mammalian cells; and d) Perform in vivo testing of the best molecules on a rodent model for malaria. Our actual work is focused on the P. falciparum Ca2+ - ATPase 6 (PfATP6) and adenylate translocase (PfAdT), two essential membrane proteins localized on the endoplasmic-reticulum and the mitochondrial membrane, respectively. We were able to express heterologously PfATP6 in yeast membranes, purify the protein and measure a specific ATPase activity. With this, we have tested a large chemical library and identified specific inhibitors. These were then tested for their effect on in vitro blood stages of P. falciparum and for their cytotoxicity on mammalian cells. For the ATP/ADP carrier PfAdT, we proceeded as previously done with PfATP6 but we have also chosen another type of functional test where we express directly this protein in the plasma membrane of E. coli. This will enable in the future the measurement of radiolabelled ATP uptake, and the identification of specific inhibitors that could then be tested for their effect on P. falciparum in vitro cultures and for their cytotoxicity.
La découverte de nouveaux agents antipaludiques est primordiale. A travers le monde, les chercheurs se sont focalisés sur plusieurs stratégies. Les plus développées sont : soit les tests de molécules issues de bibliothèques chimiques dans une recherche phénotypique (comme le test direct d’agents sur des cultures de parasites in vitro), soit la recherche de nouvelles molécules agissant sur l’activité d’une cible ou d’une voie spécifique et essentielle. Cette thèse est centrée sur le second type d’approche. Nous nous sommes intéressés aux transporteurs membranaires de P. falciparum. Pour cela, nous exprimons les protéines d’intérêt dans la levure et nous les purifions. Nous optimisons les tests fonctionnels, dans le but de : a) déterminer l’effet des molécules sur les cibles spécifiques ; b) tester leur effet sur les cultures d’érythrocytes infectés par P. falciparum in vitro ; c) vérifier leur toxicité sur des cellules de mammifères ; et d) réaliser le test des molécules les plus efficaces in vivo dans un modèle de paludisme murin. Notre travail actuel est focalisé sur l’ATPase6 de P. falciparum (PfATP6) et l’adénylate translocase (PfAdT), deux protéines membranaires essentielles localisées respectivement sur le réticulum endoplasmique et la membrane mitochondriale. Nous exprimons de manière hétérologue PfATP6 dans les membranes de levure, nous purifions la protéine et mesurons une activité ATPase spécifique. Nous avons ainsi pu tester une bibliothèque chimique importante et identifier des inhibiteurs spécifiques. Ces derniers ont ensuite été testés pour évaluer leur effet sur les stades érythrocytaires du parasite in vitro et leur cytotoxicité sur des cellules de mammifères. Pour le transporteur PfAdT, nous procédons comme pour PfATP6, mais nous avons choisi un autre type de test fonctionnel dans lequel la protéine est directement exprimée sur la membrane plasmique d’E. coli. Cela devrait permettre de mesurer le transport d’ATP radiomarqué, et l’identification d’inhibiteurs spécifiques dont les effets pourront être évalués sur des cultures de parasites in vitro et dans des essais de cytotoxicité.
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